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精子显微镜注射技术过程是怎样的

  受精卵虽然是由一个精子和一个卵子结合形成,但生育年龄的男性在一次正常的交合后,生育年龄的女性的一个卵子需要和射出的精液中难以记数的精子在输卵管相遇才能完成受精过程。仅一个精子和一个正常的卵子成功地自然受精几乎是不可能的事。在显微镜下将人的一个精子直接注射到一个卵子中,然后将其重新放回妇女的子宫并受孕成功这一技术被普遍应用。

  第1步.显微注射系统主要的仪器包括倒置显微镜和置于它两侧的显微操作仪。倒置显微镜的光学系统应具有三维立体视觉,对精子形态观察可以细致入微,辨别优劣。载物台配置37℃恒温垫板,以保证注射时卵子的温度恒定。操作仪的持卵侧容易控制,持卵针可自己拉制。持卵针的前端要平滑,内径要小,以免吸进卵细胞质。持卵针外径要比卵的直径略小为宜。

  操作仪的注射有两个关键性问题要注意:
  ,注射侧的整个压力传导系统一定要密闭,且操作要灵敏。传导系统的塑料管内充填的无论是油质还是水质材料以不产生气泡为佳。一旦有气泡产生,说明压力传导系统有漏气,定将导致精子的吸入和推出不能控制自如,注射过程不能顺利完成。注射系统的塑料管是透明的,有气泡能及时发现。固定注射针的固定器有金属和有机玻璃两种,有机玻璃的固定器是透明的,如有气泡产生易于发现而及时排除(美国Sutter-Instrument Company,CA)。但使用何种操作系统,要根据操作者的习惯来选择。

  第二个关键性问题是注射针的质量,注射针口径的大小和注射针尖的锐利程度关系到精子注入的成败,一旦发现针的质量有问题,不可勉强凑合使用,应及时更换。

  第2步.精子制动与注射持卵针和注射针分别安装到固定器上,持卵针和注射针要调至一个平面水平,左右呈一条直线。注射针的前端要与皿底平行。

  第3步.将准备好的上游精子用拉制好的细玻璃管吸几个微升至培养皿中的PvP滴中,在20倍物镜下寻找形态正常、游动的精子,用注射针的前端贴培养皿底压住精子尾部中段,注射针对尾部施压摩擦至擦破尾部的质膜,然后先尾部后头部将精子缓慢吸入注射针前端。精子制动目的不仅使注射针易于控制精子的吸人,另一目的是从尾部擦破点释放出的精子细胞质和卵子的激活有关。

  第4步.准确无误地将质量好的精子吸入注射针前端,并能控制精子在前端移动速度至关重要,控制精子的移动要达到从PVP滴移到培养液小滴的过程中不丢失精子。如果能在注射针中一次转移三个精子,且各精子之间保持一定距离,就可以加快注射速度和缩短卵子在培养箱外的时间。卵子在培养箱外的时间不宜超过30分钟,好每组卵注射时间在15分钟内完成,并及时将已注射的卵放回培养箱中。卵子放人注射皿的时间和方式根据操作者自己来定,只是要注意对卵子的保护问题。笔者的体会是,好是注射针从PVP滴吸好精子转移至培养滴后,以嘴吸控制的方式将卵子移进位于显微镜载物台上的注射皿中,以防从载物台移开注射皿,造成注射针多次暴露在空气中易引起注射针的堵塞或污染。

  第5步.在低倍镜下将吸有精子的注射针以移动注射皿的方式进入放有卵子的培养滴,持卵针降下到皿底的培养液滴吸住卵子,将第二极体定位在7点的位置。从理论上讲,纺锤丝在第二极体下方,但实际上极体可能错位,如果能在偏振光显微镜头的监察下避开纺锤丝注射更为理想。好的持卵针能稳固地吸牢卵子,卵子可接触皿底,也可悬空,两种位置都不影响注射。

  完成上述工作,镜头换成高倍镜,清楚聚焦3点钟位置的透明带和注射针尖。缓慢将精子推向针尖并快速刺入卵细胞内。卵的质膜具有高度韧性和弹性,往往针尖已深达9点的位置卵膜仍然不破。质膜已破的标准是回吸精子时卵细胞质无阻碍顺畅地流进针管,此时即可向卵细胞质内注射精子,如质膜未破则将针退回到透明带3点处换方向再行穿刺,直到将质膜刺穿精子被注射进卵子细胞质内,随后才可能发生受精过程。质膜不破,精子留在注射过程形成的质膜凹陷内,卵子不能受精。

  第6步.精子注射5至6小时后,可形成雌性和雄性原核。在临床的IVF中心,一般注射后第二天清晨检查受精情况。平均ICSI受精成功率应在80%以上,其中一个雌性原核一个雄性原核的2PN受精卵占总受精的90%左右;两个雌性原核(第二极体、未排卵)一个雄性原核的3PN受精卵时有发生,约占5%一10%,个别情况可达30%;l PN发生的情况约占5%。注射后第二天晨观察到的受精卵的两个原核应已经靠近,如果离的较远预示发育不良。

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